通常可以在反转录酶反应之前稀释DNase

因此,如果沉淀的RNA用于RT-PCR,强烈推荐使用无核酸的商品化糖原(如Ambion公司,目录号AM)。也可使用共价连接染料的糖原(如GlycoBlue,Ambion),它可以使RNA沉淀体积增大并更容易看见。

用单相裂解试剂提取的RNA样品可能包含少量的基因组DNA污染,如果此RNA后续用于RT-PCR(第7章,方案8)或实时定量RT-PCR(第9章,方案4),必须去除DNA污染,而且污染的DNA会使RNA定量不准确(见方案6)。

从RNA样品中最常用和有效的去除痕量到中等量DNA污染(大于10μg/mL)的方法是用DNaseI消化,它是一种非特异性的内切核酸酶,通过水解磷酸二酯键选择性地切割DNA(单链双链均可)。

DNase必须失活或在后续PCR应用之前被去除,否则它可能消化新生成的DNA.下面的方案中,通过加入终浓度为2.5mmolL的EDTA,然后高温加热使DNase失活。

由于高温下二价阳离子存在时RNA自发降解,所以EDTA必须在加热灭活之前加入RNA样品中。

如果样品没有进一步沉淀或基于过柱方法纯化,那么EDTA的终浓度应该充足以保护RNA不被降解,但也不能过量,否则抑制下游酶活性(如反转录酶),这些酶的活性需要二价阳离子。

通常可以在反转录酶反应之前稀释DNase处理的RNA样品,或在反转录反应中额外加入Mg2*.另外也可以用蛋白酶K于50C消化30min(μg蛋白酶K每毫升样品)灭活DNase,然后用酚:氯仿抽提,乙醇沉淀。




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