各位同学老师们大家好，新一期的高材生《硬核科普》栏目又上线啦，本期节目小编计划继续沿着当前的热点话题——新型冠状病毒，探讨一些背后的科学问题。
这次要讨论的主题是——新型冠状病毒是如何检测的？
在这次新型冠状病毒爆发的初期，确诊病例数连续多天都保持在了一个固定数值附近的增长速度，这很大程度上可能是受限于当时所采用的检测方法，整个检测流程大约需要3小时左右，因此每天能够检测的样本最大的容量也是固定的。随着社会各方大量人力物力的投入，每天能够检测的样本数量也逐渐增加，疑似病例快速被消化。可见，病毒的检测在抗击新型冠状病毒的过程中起到了举足轻重的作用。
目前通行的传染病检测手段大体可以分为两大类：核酸检测和免疫检测。截止目前，新型冠状病毒主要采取的是核酸检测，该方法被认为是传染病诊断的金标准。而前不久，国家药监局也紧急审批通过了多家基于免疫检测方法的试剂盒，很快将（或已经）投入使用。
核酸检测，顾名思义，就是直接检测病毒的特征DNA或RNA（DNA-脱氧核糖核酸、RNA-核糖核酸）来判断病人是否被感染。在核酸检测中，使用到了一种叫做聚合酶链式反应（PCR）的技术。这种方法检测灵敏度很高，但是检测流程较长，且需要专业的仪器支持。小编将在下文详细介绍。
免疫检测，是通过检测病人体内是否产生了针对病毒的特异性抗体（IgM或IgG）来判断病人是否被感染。产品可以制成试纸，最快15-20分钟左右即可出结果，使用方便，普通人在家就可以操作。当然，其结果是准确性一般，目前在临床上可以作为核酸检测的辅助和协同。这部分内容小编计划放在下期推送进行介绍。
本期推送，我们首先介绍核酸检测与PCR技术。
（据小编了解，高分子系也有课题组从事相关内容的研究，或者对PCR技术比较了解，小编才疏学浅，如果有错误欢迎各位同学老师指正！）
发展历程
年，美籍印度裔科学家HarGobindKhorana（年诺贝尔生理学和医学奖）提出一个设想：通过将DNA变性，再与合适的引物杂交，再使用DNA聚合酶延伸引物，不断重复上述过程即可克隆出tRNA基因。但由于当时的DNA测序技术不成熟，且引物人工合成上具有困难，以及70年代分子克隆技术的发明提供了另一种克隆和扩增基因的途径，这个设想很快被人们遗忘了。
（引物：指人工合成的寡核苷酸序列，与目的基因其中的一条DNA模板链通过氢键互补。在PCR中起到了标记需要复制的DNA片段的起点和终点的作用。寡核苷酸：是一类只有50个以下碱基的短链核苷酸的总称（包括脱氧核糖核酸DNA或核糖核酸RNA内的核苷酸），寡核苷酸可以很容易地和它们的互补链对接，所以常用来作为探针确定DNA或RNA的结构。）
HarGobindKhorana教授
随后直到年，美国PE-Cetus公司的KaryB.Mullis等人才发明了可以放大扩增特定的DNA片段的聚合酶链式反应（PCR）。该技术得以推广的关键是耐热性的DNA聚合酶-Taq酶的使用，使得这一技术在循环扩增的过程中不用再额外添加新的DNA聚合酶，使得这一过程的成本和出错率大大降低。随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪。PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。从此，无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出一丁点的DNA，就能用PCR加以放大，进行比对。PCR技术的诞生将生物学推向了一个崭新的时代。Mullis也因此获得了年的诺贝尔化学奖。
KaryB.Mullis
DNA双螺旋是由氢键连接在一起的，高温（90~95℃）时，氢键会发生断裂使得DNA变为单链，这一过程称为DNA的变性。而在温度降低后，单链DNA又能重新组合成双链。PCR过程正是利用了DNA的这一特点实现了DNA的复制和扩增。
标准的PCR过程分为三步：
1.DNA变性：将包括了需要扩增/复制的模板DNA、引物、Taq-DNA聚合酶和4种dNTP原料配成的含Mg2?的缓冲溶液加热至90~95℃，使得模板DNA中的氢键断裂，形成单链DNA。
2.引物退火：降温至60~65℃，引物与单链DNA模板通过形成氢键结合，在DNA与引物结合处形成局部双链。
3.引物延伸：升温至70~75℃，这是TaqDNA聚合酶的最佳工作温度，在这一阶段，DNA聚合酶将溶液中的dNTP沿着引物的3’端开始以从5’→3’（磷酸到五碳糖）的方向延伸，合成与模板DNA互补的DNA链。
完成上述一个循环大约2~4分钟，可以使DNA数量增加一倍。不断循环重复这个过程，就可以使需要复制的DNA片段数量以2的n次方数量增加。一般进行25~35个循环，在最后一个循环后在70℃左右保温30分钟左右，使得引物延伸完全，并使得单链完全退火成为双链。整个过程大约3~4小时。
（dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸，是包括dATP,dGTP,dTTP,dCTP,等在内的统称，N是指含氮碱基，代表变量指代A、T、G、C、U等中的一种，是合成DNA片段的原料）
综上所述，PCR热循环仪的本质其实就是一台可以快速准确控制温度的恒温箱。后续其他多种应用（例如荧光PCR、逆转录PCR等）均是在此反应基础上的扩展。
PCR热循环仪
具体到新型冠状病毒的检测，其实就是利用了一种叫实时荧光定量PCR的技术，通过将荧光染料或者荧光标记的特异性探针引入反应体系，标记跟踪PCR产物，通过探测荧光型号的强度，可以实时监测PCR反应中DNA扩增的过程，再结合专业的软件进行分析，即可计算出待测DNA模板的初始浓度。
荧光定量PCR
所以，新型冠状病毒检测试剂盒的开发及使用过程如下：
首先，当然是要取得新型冠状病毒的测序结果，由于新型冠状病毒是RNA病毒，而PCR技术只能扩增DNA，因此检测过程中可能需要先将RNA逆转录为DNA，再进行PCR扩增。
随后，生产检测试剂盒的公司需要根据测序结果找出新型冠状病毒特异性的DNA片段，并籍此设计出适用于该病毒检测的引物（引物的设计需要遵循一些基本原则，目前已有很多商业软件可以实现）。随后生产适用于检测新型冠状病毒的试剂盒，医院（试剂盒中应该包括设计好的引物、聚合酶、dNTP、荧光染料等）。
医院在采集了病人的生物样本（如咽拭子、鼻拭子、痰液、支气管灌洗液、肺泡灌洗液等）后，首先进行除去杂质、纯化等操作，再根据试剂盒中说明书的要求将各组分配置成适当浓度的PCR溶液，送入荧光PCR仪器中进行扩增。
如果病人感染了新型冠状病毒，DNA模板会正常扩增，几个循环后，仪器就能够检测到荧光信号，当达到一定荧光阈值所需的PCR循环数（Ct值）小于说明书所规定的值，则判断为阳性；如果病人没有感染病毒，那引物就找不到对应的DNA片段，DNA数目无法增加，数十个循环后仍然没有足够达到仪器阈值的荧光信号产生，即判断为阴性。
当然，由于RNA容易降解，以及其他技术性的原因，这一过程中还会出现假阴性或者假阳性等问题，需要对患者进行反复检测或者采用其他方法双重验证，才能最大程度保证检测的准确性，小编在此不再详细展开了。
最后，小编为大家找到一个视频，生动简洁地介绍了PCR技术的原理：
以上就是本期硬核科普的全部内容，有关新型冠状病毒的免疫检测，且听下回分解。
本期推送特别感谢高分子系杨武利教授、张栩诚同学、生科院周国强同学、梁雪同学的指导和建议！
参考资料：
1.百度百科词条：聚合酶链式反应、引物、dNTP、寡核苷酸、荧光定量PCR
2.《核酸检测技术讲解》ppt
3.国家药品监督管理局医疗器械技术审评中心《一文读懂新型冠状病毒的核酸检测！》
4.视频《ThePolymeraseChainReaction(PCR)》Sumanas,Inc.
编辑整理：温蕴周
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